Ak ste niekedy strávili hodiny monitorovaním živých buniek – pozorovaním, ako sa delia, reagujú na lieky alebo migrujú v reálnom čase – viete, že priepasť medzi nespracovanými údajmi a použiteľným prehľadom často spočíva v tom, čo váš systém dokáže nad rámec základného nastavenia. Ako dodávateľ živého zobrazovacieho systému sa každý týždeň rozprávam s výskumníkmi, ktorí nedostatočne využívajú svoje vybavenie, pretože nepoznajú inovácie, ktoré z dobrého zobrazovača spravia flexibilný a vysoko výkonný nástroj prispôsobený ich práci. Poďme si rozobrať inovácie, ktoré predstavujú najväčší rozdiel, od dostupnosti pre vedcov na lavičke až po presnosť pre špecializované štúdie.
Po prvé, je dôležité začať s jadrom: základný systém je navrhnutý tak, aby sa prispôsobil, ale pridanie cielených aktualizácií hardvéru je miesto, kde vidíte okamžité zisky. Najbežnejšie požiadavky na aktualizáciu, ktoré dostávam, spadajú do troch kategórií hardvéru: optický, environmentálna kontrola a manipulácia so vzorkami. Pre optické upgrady to zvyčajne znamená úpravu schopnosti systému zachytiť viac detailov bez narušenia živých buniek. Väčšina základných nastavení zobrazovacieho systému živých buniek sa dodáva so štandardnými šošovkami objektívu, ale výmena objektívov s ponorením do vody na dlhú vzdialenosť (LWD) je prelomová pre prácu s hrubými vzorkami, ako sú organoidy alebo sféroidy. Tieto šošovky majú dlhší tubus, ktorý vám umožňuje zamerať sa hlbšie do štruktúr podobných tkanivu bez stláčania alebo poškodenia buniek, čo je rozhodujúce pri štúdiu 3D kultúr, ktoré sa správajú veľmi odlišne od plochých monovrstiev. Pre výskumníkov zameraných na prácu s vysokým zväčšením - ako je sledovanie dynamiky jedného proteínu v adherentných bunkách - pridanie objektívu s vysokou numerickou apertúrou (NA) s olejovou imerziou znižuje rozptyl svetla a vytvára ostrejšie obrázky, aj keď ho musíte spárovať so stabilným stolíkom, aby ste sa vyhli posunu.
Potom je tu osvetlenie, často prehliadaná aktualizácia hardvéru, ktorá priamo ovplyvňuje zdravie buniek. Základné systémy živých buniek používajú štandardné halogénové alebo LED žiarovky, ale prepnutie na laditeľný svetelný zdroj (ako je laserová čiara alebo vysokorýchlostný LED panel) vám umožňuje nastaviť vlnové dĺžky budenia s presnosťou na nanometre. Napríklad, ak sledujete dva fluorescenčné proteíny, ktoré sú blízko spektra – povedzme GFP a EGFP – laditeľný svetelný zdroj zaistí, že budete vzrušujúci len ten, ktorý chcete, čím sa zníži presluchy, ktoré zamieňajú vaše údaje. Videl som tiež, že výskumníci upgradovali na konfokálnu jednotku s rotujúcim diskom namiesto štandardného širokoúhlého nastavenia. Široké pole môže spôsobiť odfarbenie a fototoxicitu, najmä pri snímaní časozberných obrázkov v priebehu hodín alebo dní; drobné dierky otáčajúceho sa disku blokujú neostré svetlo a znižujú celkovú svetelnú expozíciu buniek, čo vám umožňuje fotiť dlhšie bez toho, aby sa zmenilo ich správanie. Ak si nie ste istí, kde začať, základný zobrazovací systém živých buniek, ktorý je tu pripojený, je už kompatibilný s väčšinou týchto optických doplnkov, takže pri inovácii nemusíte vymieňať celé nastavenie.
Kontrola prostredia je pre živé bunky nevyjednávateľná a modernizácia je často rozdielom medzi získavaním spoľahlivých údajov a sledovaním odumierania buniek uprostred experimentu. Základné inkubátorové komory, ktoré kontrolujú iba teplotu a CO₂, fungujú na krátke časové úseky, ale dlhodobé štúdie – ako sledovanie diferenciácie kmeňových buniek počas týždňa alebo odozvy na liek počas niekoľkých dní – si vyžadujú presnejšiu kontrolu. Úplné vylepšenie prostredia zahŕňa vyhrievaný stupeň, ktorý udržuje teplotu v rozmedzí 0,1 °C, regulátor CO₂ a O₂ na napodobňovanie fyziologických hladín plynov a monitor vlhkosti, ktorý zabraňuje vyparovaniu média. Pre výskumníkov pracujúcich s bunkami citlivými aj na drobné zmeny, ako sú primárne neuróny, pridanie inkubátora na vrchnej časti, ktorý sa hodí priamo na stolík mikroskopu, eliminuje teplotné gradienty, ktoré vznikajú pri presúvaní vzoriek medzi inkubátorom a zobrazovačom. Ďalšou inováciou je motorizovaný stolík s piezo z-pohonom, ktorý vám umožňuje automaticky zachytiť z-zásobníky a upraviť ohniskovú rovinu v milisekundách – čo je kritické pre 3D zobrazovanie alebo časozbery, kde sa bunky pohybujú vertikálne.
Vylepšenia spracovania vzoriek sú pre prípad, keď potrebujete zobraziť viac vzoriek alebo viac rôznych vzoriek bez manuálneho zásahu. Mnoho základných systémov používa pevné držiaky vzoriek pre 96-jamkové platne, ale pridanie motorizovaného nakladača platničiek alebo viacjamkového karuselu vám umožní vykonávať experimenty cez noc alebo cez víkend bez výskumníka na pracovisku. Pre aplikácie vysokovýkonného skríningu (HTS) je integrácia adaptéra na manipuláciu s kvapalinou, ktorý môže pridávať lieky alebo médiá do jamiek uprostred experimentu, obrovskou úsporou času – nemusíte prerušovať experiment, aby ste ošetrili vzorky, čo môže narušiť správanie buniek. Ak pracujete s malými vzorkami, ako sú mikrofluidné čipy alebo misky so skleneným dnom, je nevyhnutná inovácia na flexibilný držiak vzoriek, ktorý pojme vlastné formáty; veľa základných držiakov sa hodí len na štandardné 96- alebo 384-jamkové platne, takže táto aktualizácia otvára vaše experimenty novým typom testov.
Teraz je druhou polovicou upgradov softvér a automatizácia, a práve tu rýchlejšie premieňate nespracované obrazové údaje na zmysluplné výsledky. Videl som výskumníkov, ktorí trávia viac ako 10 hodín týždenne manuálnou analýzou obrázkov z ich živého bunkového systému, čo je nielen neefektívne, ale aj náchylné na ľudské chyby. Najväčšou softvérovou inováciou, ktorú by väčšina ľudí mala zvážiť, je inteligentná platforma skenovania a analýzy. Náš systém inteligentného skenovania Live Cell je vytvorený špeciálne na tento účel, ale aj softvérové nástroje tretích strán, ktoré sa integrujú do vášho základného systému, môžu znamenať obrovský rozdiel.
Upgrady automatizácie sú tu prvým krokom. Namiesto manuálneho nastavovania každého časozberného experimentu – úpravy ohniskovej roviny, definovania oblastí záujmu (ROI) a nastavovania časových intervalov – vám automatizačný softvér umožňuje naprogramovať celý experiment v priebehu niekoľkých minút. Napríklad, ak študujete migráciu buniek, môžete systém nastaviť tak, aby skenoval iba okraje každej jamky, kde rastú bunky, vynechával prázdne oblasti a automaticky upravoval časový interval, ak sa hustota buniek zmení. To nielen skracuje čas nastavenia, ale tiež zaisťuje konzistentnosť medzi replikáciami, čo je kľúčové pre publikovateľné údaje. Ďalšou automatizačnou funkciou je sledovanie zaostrenia: ak sa bunky počas experimentu pohybujú horizontálne alebo vertikálne, systém každých pár sekúnd automaticky upraví ohniskovú rovinu, takže nikdy nezískate rozmazané obrázky ani pri viacdenných časozberoch.
Aktualizácie analytického softvéru sú miestom, kde skutočne spracovávate údaje, a existujú dva hlavné typy prispôsobené rôznym experimentom. Pre funkčné štúdie – ako je sledovanie toku vápnika alebo translokácie proteínov – sú skvelé nástroje analýzy s jedným testom, ktoré automaticky merajú špecifické parametre. Môžete zadať metriky, ako napríklad „spočítať počet buniek, ktoré sa posunuli o viac ako 50 mikrónov“ alebo „zmerať intenzitu fluorescencie GFP lokalizovaného v jadre v priebehu času“ a softvér bude analyzovať každý obrázok vo vašom časozbere v priebehu niekoľkých minút. Pre komplexnejšie štúdie, ako je 3D rast organoidov alebo kokultivačné testy, môže analytický softvér založený na strojovom učení segmentovať populácie buniek (dokonca aj prekrývajúce sa) a rozlišovať medzi rôznymi typmi buniek. Ide o obrovský upgrade, pretože manuálna segmentácia 3D obrázkov môže trvať niekoľko dní a je to subjektívne – nástroje strojového učenia sa učia z vašich anotovaných obrázkov, aby zakaždým produkovali konzistentné a nezaujaté výsledky. Jednou z bežných chýb, ktoré výskumníci robia, je držať sa základného softvéru, ktorý sa dodáva s ich systémom; upgrade na flexibilnú analytickú platformu vám umožní prispôsobiť sa novým testom bez toho, aby ste sa zakaždým učili nový nástroj.
Existujú aj cielené upgrady pre špecializované výskumné oblasti, ktoré som videl veľa novších výskumníkov prehliadať. Imunológom, ktorí študujú interakciu bunka-bunka, vám pridanie modulu na prenos energie fluorescenčnej rezonancie (FRET) umožňuje merať molekulárne interakcie medzi dvoma bunkami, ako je aktivácia T buniek pri väzbe na bunku prezentujúcu antigén. To si vyžaduje zdroj svetla, ktorý dokáže vybudiť dva fluorofóry naraz, a detektor, ktorý dokáže zachytiť signál FRET bez šumu v pozadí. Pre neurovedcov je pridanie vylepšenia blízkeho infračerveného (NIR) zobrazovania kritické, pretože NIR svetlo preniká hlbšie do tkaniva a spôsobuje menšiu fototoxicitu ako viditeľné svetlo, takže môžete zobrazovať mozgové rezy alebo in vivo zvieracie modely počas dlhšieho obdobia. Výskumníkom v oblasti kmeňových buniek pridanie modulu fázového kontrastu s automatickým nastavením kontrastu umožňuje zobraziť bunky bez fluorescenčných značiek, čím sa zabráni zmene správania buniek a zníži sa fototoxicita. Tieto špecializované vylepšenia nie sú pre každé laboratórium, ale ak sa vaša práca zameriava na konkrétnu oblasť, premenia všeobecný zobrazovací systém živých buniek na nástroj, ktorý je vytvorený pre vaše presné experimenty.
Veľa výskumníkov sa ma pýta, či upgrady stoja za tie náklady, a krátka odpoveď je: väčšinou áno – najmä ak používate svoj systém 10+ hodín týždenne. Videl som v laboratóriu vylepšiť svoj základný systém konfokálnym a automatizačným softvérom s rotujúcim diskom a oni prešli z 2 malých experimentov týždenne na 10 s kvalitou dát, ktorá bola lepšia ako u systému vyššej kategórie, o ktorom uvažovali o kúpe. Je však dôležité naplánovať aktualizácie vopred; niektoré laboratóriá čakajú, kým ich základný systém nebude zastaraný, ale postupné pridávanie aktualizácií (namiesto výmeny celého systému každých pár rokov) je nákladovo efektívnejšie. Ak napríklad začnete so základným systémom, po 6 mesiacoch pridáte inováciu riadenia životného prostredia a po roku pridáte automatizačný softvér, rozložíte náklady a krok za krokom vylepšíte svoje experimenty.
Ďalším kľúčovým bodom je kompatibilita: nie všetky aktualizácie fungujú s každým systémom, takže je dôležité, aby ste si to overili u svojho dodávateľa. Keď hovorím s výskumníkmi, ktorí sa pozerajú na vylepšenia, vždy im odporúčam, aby najprv vymenovali svoje súčasné bolestivé body a plány do budúcnosti. Ak plánujete urobiť HTS v budúcom roku, uprednostnite automatizáciu a manipuláciu so vzorkami vo viacerých jamkách. Ak prechádzate na 3D kultúru, uprednostnite optické a environmentálne inovácie. Náš zobrazovací systém živých buniek je navrhnutý tak, aby fungoval s väčšinou bežných upgradov, takže sa nemusíte obávať, že diely do seba nezapadajú.
Na konci dňa sú najlepšie vylepšenia tie, ktoré vyriešia vaše špecifické výzvy. Či už ste vedec na lavičke unavený manuálnou analýzou časozberných obrázkov, výskumník v oblasti liekov, ktorý potrebuje spustiť viac testov HTS, alebo vývojový biológ študujúci rast organoidov, existuje vylepšenie, ktoré vám uľahčí prácu a vaše údaje budú spoľahlivejšie. Ak vás zaujíma, aké vylepšenia by vyhovovali vášmu súčasnému nastaveniu zobrazovania živých buniek, alebo ak chcete vytvoriť systém od nuly, neváhajte a oslovte a prediskutovajte svoje potreby.
Referencie:
- Medzinárodná spoločnosť pre pokrok v cytometrii. (2022). Osvedčené postupy pre zobrazovanie živých buniek: Zníženie fototoxicity a fotobielenia.Cytometria časť A, 101 (8), 623-635.
- Zhang, Y., a kol. (2021). Inovácie hardvéru a softvéru na zobrazovacie systémy živých buniek pre vysokovýkonnú analýzu jednej bunky.Journal of Biomolecular Screening, 26(7), 541-552.
- Wang, L., a kol. (2020). Systémy kontroly prostredia pre dlhodobé zobrazovanie živých buniek: Kľúčové úvahy pre fyziologicky relevantné experimenty.Biotechnologické pokroky40, 107562.
- Európske laboratórium molekulárnej biológie. (2023). Nástroje automatizácie a AI pre analýzu zobrazovania živých buniek: Sprievodca pre vedcov na lavičke.Prírodné metódy20(5), 678-689.
