Ak ste sa niekedy zúčastnili experimentu s analýzou správania zvierat, viete, že sa deje oveľa viac, než len sledovať zvieratá, ako robia svoje veci. Laboratórna myš preháňajúca sa labyrintom, zebra vrhajúca sa v nádrži – každý malý detail môže zničiť vaše údaje, ak si nedáte pozor. To je dôvod, prečo je kontrola premenných základom výskumu správania zvierat. Už roky sa venujem hre na analýzu správania zvierat, spolupracujem s laboratóriami a výskumníkmi a povedzme si pravdu: nie je to len o tom, že máme skvelé nástroje – je to o nájdení každej premennej, dokonca aj tých, o ktorých si myslíte, že na nich nezáleží.
Najprv si povedzme o tých veľkých, ktoré nemôžete prehliadnuť: o biologických premenných. Nie je to len „koľko rokov má myš“ (aj keď je to obrovské). Námaha, sex, zdravie, dokonca aj cirkadiánny rytmus – to všetko mení správanie. Raz som mal jedného výskumníka, ktorý za mnou prišiel v panike, pretože výkon ich testovacej skupiny v bludisku bol všadeprítomný. Ukázalo sa, že zmiešali dva kmene myší: C57BL/6, ktoré sú super svetlé, a BALB/c, ktoré sú oveľa úzkostnejšie. Niet divu, že údaje boli neporiadok. Takže prvý krok: štandardizujte svoje predmety čo najviac. Ak nemôžete použiť presne rovnaký kmeň, pohlavie a vek pre každú skupinu, aspoň rozdeľte tieto premenné rovnomerne medzi kontrolné a testovacie skupiny.
Cirkadiánny rytmus je ďalší rytmus, ktorý ľudí podrazí. Zvieratá sa o 9:00 nesprávajú rovnako ako o 21:00 Myši sú nočné, však? Ak testujete myš na konci svetelného cyklu (keď je unavená), bude sa pohybovať oveľa pomalšie, ako keby ste ju testovali v tme. Klienti prispôsobili svoje plány testovania tak, aby zodpovedali aktívnym časom ich subjektov, a ich konzistencia údajov vyskočila cez strechu. Je to malá úprava, ale prináša obrovský rozdiel.
Ďalej premenné prostredia. Toto je miesto, kde sa samotné laboratórne nastavenie môže stať premennou, ak to dovolíte. Osvetlenie, zvuk, teplota, vlhkosť – všetky tieto veci ovplyvňujú správanie zvierat. Videl som, že výsledky laboratória vo vodnom bludisku sú skreslené, pretože AC fúkalo priamo na jednu stranu nádrže, takže tam bola voda mierne chladnejšia. Pre myši môže dokonca aj vôňa parfumu nového výskumníka vystresovať a zmeniť ich správanie.
To je dôvod, prečo používanie špecializovaných systémov, ako je naše bludisko s radiálnymi ramenami, predstavuje obrovský rozdiel. Počkaj, ak si to chceš overiť, je to tu:Bludisko s radiálnym ramenom. Tento systém nie je len labyrint – je to kontrolované prostredie s konzistentným osvetlením, hladinami zvuku a dokonca aj sledovačmi, ktoré zaznamenávajú každý pohyb, takže sa nemusíte obávať ľudskej chyby pri počítaní vstupov paží. Samotné bludisko je navrhnuté tak, aby minimalizovalo vonkajšie rozptyľovanie, takže si môžete byť istí, že akékoľvek zmeny, ktoré v správaní uvidíte, pochádzajú z vašej skutočnej testovacej premennej, nie z miestnosti.
Potom sú tu premenné súvisiace s tým, ako spustíte samotný test. Psovodi, testovacie protokoly, dokonca aj poradie, v ktorom testujete zvieratá – to všetko môže spôsobiť zaujatosť. Napríklad, ak jeden výskumník manipuluje s kontrolnou skupinou a iný s testovacou skupinou, zvieratá môžu reagovať odlišne na každú osobu, čo skresľuje výsledky. Tomu sa hovorí zaujatosť experimentátora a je oveľa bežnejšia, ako si ľudia myslia.
Odporúčame trénovať všetkých testerov rovnakým spôsobom, používať rovnaké manipulačné techniky, aby zvieratá nezachytili jemné rozdiely v tom, ako ich chytia alebo s nimi hovoria. Taktiež náhodným výberom poradia testovania – nerobte najskôr všetky kontrolné zvieratá, potom všetky testovacie. Zmiešajte to, takže akékoľvek malé zmeny v laboratóriu v priebehu dňa (napríklad stlmenie osvetlenia alebo spustenie klimatizácie) ovplyvňujú obe skupiny rovnako.
Teraz sa pozrime na rôzne typy testov správania, pretože variabilné riadenie vyzerá trochu inak v závislosti od toho, čo študujete. Vezmite si napríklad svrbenie (svrbenie). Ak testujete, ako liek ovplyvňuje reakciu na svrbenie, musíte okrem lieku kontrolovať všetko, čo by mohlo zviera poškriabať. To je miesto, kde prichádza na rad náš systém analýzy správania zvieracieho svrbenia – pozrite si ho tu:Systém analýzy správania zvierat pruritus. Tento systém využíva sledovanie videa na presné spočítanie toho, koľkokrát sa zviera poškriabe, a je nastavený tak, aby eliminoval rušivé vplyvy, takže si náhodnú starostlivosť nepomýlite so škrabaním súvisiacim so svrbením. Ovláda tiež veci, ako je poloha zvieraťa (sedenie vs. státie môže zmeniť, ako veľmi sa škrabe) a dokonca aj dennú dobu, takže údaje o svrbení sú pevné ako skala.
Analýza chôdze je ďalšou oblasťou, kde je kritická variabilná kontrola. Ak študujete, ako zranenie alebo droga ovplyvňuje chôdzu zvieraťa, drobné rozdiely v nastavení testu môžu spôsobiť, že sa chôdza mení, keď ide len o nastavenie. Náš jednokanálový (multi)kanálový systém analýzy chôdze s vysokým rozlíšením je na to vytvorený – tu je odkaz:Jednokanálový (multi)kanálový systém analýzy chôdze s vysokým rozlíšením. Používa tlakové senzory a vysokorýchlostné kamery, ktoré sú zakaždým kalibrované, takže chôdza každého zvieraťa je meraná za rovnakých podmienok. Už žiadne nerovné povrchy podláh alebo nekonzistentné uhly kamery, ktoré si zasahujú do vašich údajov. Neurovedecké laboratóriá to použili na sledovanie zmien chôdze u myší súvisiacich s Parkinsonovou chorobou a povedali nám, že údaje sú oveľa reprodukovateľnejšie ako pri ich starom nastavení.
A čo zebrička? Sú veľmi bežné vo vývojovom a neurovedeckom výskume a testovanie ich vestibulárneho očného reflexu (VOR) je veľkou súčasťou toho. VOR je to, čo udržuje ich zrak stabilný, keď plávajú, takže ak je vypnutý, informuje vás o funkcii vnútorného ucha alebo mozgu. Ovládanie premenných tu znamená uistiť sa, že nádrž je dokonale nehybná, teplota vody je konzistentná a vizuálne podnety sú zakaždým rovnaké. To je dôvod, prečo je náš testovací systém Zebrafish Vestibular Ocular Reflex Testing System navrhnutý tak, aby to všetko dokázal – odkaz tu:Testovací systém vestibulárneho očného reflexu Zebrafish. Ovláda prietok vody, úrovne osvetlenia a frekvenciu stimulov, takže si môžete byť istí, že akékoľvek zmeny vo VOR pochádzajú od vášho testovaného subjektu, nie od prostredia. Spolupracujeme s mnohými laboratóriami zobričiek a prisahajú na tento systém, že znižuje variabilitu údajov.
A nezabudnime na sluchové testovanie, ako sú testy odozvy myšacieho mozgového kmeňa (ABR). Ak študujete poruchu sluchu alebo ako droga ovplyvňuje sluch, musíte sa uistiť, že zvukové podnety sú pre každé zviera úplne rovnaké a že výsledky neovplyvňuje hluk v pozadí. Náš systém testovania odozvy myšacieho sluchového kmeňa je na to vytvorený – pozrite si ho tu:Systém testovania odozvy sluchového mozgového kmeňa myši. Používa zvukotesné komory, kalibrované reproduktory a konzistentné umiestnenie elektród, takže vaše údaje ABR sú presné a spoľahlivé. Výskumník, s ktorým som pracoval, predtým používal základné nastavenie ABR a ich prahové údaje mali 10-decibelový rozdiel medzi zvieratami, ktoré by mali byť rovnaké. Po prechode na náš systém tento rozdiel klesol na menej ako 2 decibely – obrovské na interpretáciu zmien sluchu.
Počkajte, ale aj so všetkými vychytenými nástrojmi je tu jedna premenná, ktorú ľahko prehliadnete: analýzu údajov. Spôsob, akým kódujete a hodnotíte správanie, môže tiež spôsobiť zaujatosť. Ak manuálne vyhodnocujete video o správaní zvierat, pravdepodobnejšie započítate správanie, ak je v testovacej skupine, však? Preto je lepšie používať automatické sledovanie (ako systémy, ktoré ponúkame), ale ak musíte bodovať manuálne, použite slepé bodovanie. To znamená, že osoba, ktorá video hodnotí, nevie, v ktorej skupine sa zviera nachádza – len pozerajú video a počítajú správanie bez toho, aby vedeli, či ide o kontrolu alebo test. Nemôžem vám povedať, koľkokrát to boli opravené nešťastné údaje. Pri nastavovaní našich systémov školíme všetkých našich klientov o bodovaní naslepo, pretože je to jednoduchý krok, ktorý robí obrovský rozdiel.
Ďalšia vec: veľkosť vzorky. Mnoho výskumníkov to preskakuje, ale ak je vaša vzorka príliš malá, náhodné variácie môžu spôsobiť, že vaše údaje budú vyzerať ako skutočný efekt, keď to tak nie je. Tomu sa hovorí chyba I. typu. Pomáhame klientom určiť správnu veľkosť vzorky na základe ich typu testu a premenných, aby nestrácali čas (a peniaze) na experimenty, ktoré nemajú dostatok údajov na to, aby mali zmysel. Ak napríklad spúšťate test v bludisku s radiálnym ramenom na myšiach, možno budete potrebovať 15 až 20 zvierat na skupinu, aby ste dosiahli konzistentné výsledky – príliš málo a jedna myš, ktorá je mimoriadne úzkostlivá, môže odhodiť celú skupinu.
Dovoľte mi podeliť sa o krátky príbeh, ktorý priviedol tento domov. Pred niekoľkými mesiacmi k nám prišiel nový klient, frustrovaný, pretože jeho predchádzajúci experiment s bludiskom mal protichodné výsledky. Použili dva rôzne kmene myší, testovali ich v náhodných časoch dňa a sami hodnotili videá s bludiskom (s vedomím, čo bol test vs. kontrola). Pracovali sme s nimi, aby sme opravili všetky premenné: použili sme iba jeden kmeň, testovali sme každý deň v rovnakom čase (počas tmavej fázy, keď sú myši aktívne) a nechali sme videá naslepo hodnotiť treťou stranou. Keď znova vykonali test s naším bludiskom s radiálnym ramenom, výsledky boli krištáľovo jasné – už žiadne protichodné údaje. Nakoniec tieto zistenia zverejnili a povedali nám, že jediný dôvod, prečo prvý experiment zlyhal, bol ten, že nekontrolovali premenné. To je vec správania zvierat: nie je to raketová veda, ale je ľahké nechať malé premenné prekĺznuť cez trhliny.
Takže, aby sme to zabalili: kontrola premenných v analýze správania zvierat je o zámere. Začnite štandardizáciou svojich predmetov (napätie, pohlavie, vek, zdravotný stav), prispôsobte si prostredie (osvetlenie, zvuk, teplota), kontrolujte spôsob vykonania testu (obslužná osoba, príkaz, podnety), použite nástroje určené na presné meranie a uistite sa, že vaša analýza údajov je nezaujatá. Preskočte skratky – dokonca aj tie najmenšie, ako je testovanie v nesprávny čas alebo miešanie kmeňov – a získate oveľa spoľahlivejšie údaje.
Ak hľadáte sprísnenie kontroly premenných, či už robíte testy v bludisku, testy svrbenia, analýzu chôdze, testy VOR zebričiek alebo ABR myší, máme systémy, ktoré vám pomôžu. Spolupracujeme s laboratóriami všetkých veľkostí, od malých akademických tímov až po veľké farmaceutické spoločnosti, a sme tu, aby sme vás previedli každým krokom – od nastavenia nástrojov až po zabezpečenie maximálnej kontroly nad experimentom. Žiadny žargón, žiadne obruče, len priame reči o zlepšení vašich údajov. Obráťte sa na nás, keď budete pripravení posunúť svoju analýzu správania zvierat na vyššiu úroveň, a uistime sa, že váš ďalší experiment vám poskytne jasné a dôveryhodné výsledky, ktoré potrebujete.
Referencie:
- Garland Jr, T. a Adolph, JS (1994). Fyziologická diferenciácia genotypov stavovcov. Americký zoológ, 34 (1), 151-165.
- Crabbe, JC, Wahlsten, D., & Dudek, BC (1999). Genetika správania myší: interakcie s laboratórnym prostredím. Science, 284(5420), 1670-1672.
- Blanchard, DC a Blanchard, RJ (1988). Etoexperimentálne prístupy k biológii emócií. Annual Review of Psychology, 39(1), 43-68.
- Metten, P., Crabbe, JC, & Rhodes, JS (2005). čo je normálne? Variabilita správania u laboratórnych myší. Current Opinion in Neurobiology, 15(2), 145-150.
- Prescott, MJ, & Prescott, A. (2011). Využitie zvieracích modelov v senzorickom výskume. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 366(1581), 3002-3013.
