Ak ste niekedy strávili hodiny nastavovaním bunkového zobrazovania, len aby ste zistili, že vaše obrázky sú rozmazané, pretože zaostrenie sa posunulo uprostred záberu, viete, aká frustrujúca môže byť presnosť automatického zaostrovania (AF). Ako niekto, kto sa už roky venuje hre bunkového zobrazovacieho systému – každý deň sa rozpráva s výskumníkmi, biológmi a laboratórnymi technikmi – vám poviem toto: Presnosť AF nie je len technická špecifikácia. Je rozdiel medzi zverejňovaním solídnych údajov a opakovaním týždenných experimentov, nehovoriac o tom, že váš tím ušetrí nespočetné množstvo nocí. Dnes si poďme rozobrať, čo to vlastne znamená, prečo je to pre bunkovú prácu „zlomiť alebo zlomiť“ a ako sa naše systémy ukladajú, keď je to najdôležitejšie.
Najprv si ujasnime základy: presnosť automatického zaostrovania je to, ako presne sa dokáže zobrazovací systém zamerať na ohniskovú rovinu vašej vzorky, až na úroveň mikrónov. Pre prácu s bunkami je to oveľa kritickejšie, ako to znie. Väčšina buniek má veľkosť 1 až 100 mikrónov – predstavte si, že 1 mikrón je asi 1/100 hrúbky ľudského vlasu. Ak je váš AF vypnutý čo i len o 2 mikróny, zameriavate sa buď na sklenené krycie sklíčko, na ktorom sú bunky, alebo na médium nad nimi – nie na samotné bunky. To je veľký problém pre čokoľvek od časozberného sledovania živých buniek až po imunofluorescenciu s fixnými bunkami, kde aj malý posun môže vymyť signály alebo vytvoriť falošné pozitíva.
Ale tu je vec: presnosť nie je univerzálne číslo. Závisí to od toho, čo zobrazujete, ako to zobrazujete a od podmienok vo vašom laboratóriu. Napríklad fixované bunky na plochom krycom sklíčku sa dajú oveľa ľahšie zamerať ako živé bunky rastúce v 3D sféroidoch, kde vzorka nie je jedna plochá rovina. Alebo ak robíte snímky s vysokým zväčšením (napríklad 60x alebo 100x olejová imerzia), vaša hĺbka ostrosti je veľmi úzka – často menej ako 1 mikrón – takže aj 0,5 mikrónová chyba AF zabije váš obrázok. Preto, keď hovoríme o systémoch, musíte sa pozerať na presnosť v reálnych scenároch, nielen na marketingové špecifikácie výrobcu.
Poďme sa porozprávať o bežných problémoch, ktoré počúvame od zákazníkov, pretože práve tam presnosť skutočne ukazuje svoje nedostatky. Najväčší je drift – tepelný drift aj optický drift. Ak robíte časozberný beh, ktorý trvá celé hodiny, komponenty systému (ako šošovka objektívu, stolík alebo fotoaparát) sa môžu zahriať a posunúť ohniskovú rovinu natoľko, že do 10. hodiny budú vaše bunky rozmazané. Zákazníci nám povedali, že staré systémy by sa posunuli o 5 až 10 mikrónov počas 24-hodinového časového intervalu, čo znamenalo, že museli zastaviť chod a znova zaostriť manuálne, čím sa plytvalo činidlom a časom, ktorý mohli stráviť analýzou údajov. Ďalším veľkým je automatické zaostrovanie založené na kontraste, čo je najbežnejšia metóda v rozpočtových systémoch. Kontrastné automatické zaostrovanie funguje tak, že hľadá najostrejšie hrany na obrázku, ale ak je vaša vzorka slabá (napríklad fluorescenčné proteíny s nízkou expresiou) alebo má veľa šumu v pozadí, môže sa zachytiť na nesprávnom mieste – povedzme, škvrna úlomkov na krycom sklíčku namiesto buniek. Fázový kontrast AF je na to lepší, ale stále má problémy s nerovnými povrchmi vzoriek, ako sú 3D kultúry alebo organoidy.
To je miesto, kde technológia za vaším systémom robí rozdiel. Mnoho základných systémov na zobrazovanie buniek používa základné kontrastné AF, ktoré je raz kalibrované vo výrobe a nikdy sa neupravuje pre skutočné laboratórne podmienky. Naše systémy sme však vytvorili tak, aby zvládli tieto chaotické scenáre v reálnom svete, a preto sme strávili toľko času zdokonaľovaním našej technológie automatického zaostrovania. Pre každého, kto pracuje so živými ukážkami, správny systém potrebuje nielen uzamknúť zaostrenie raz, ale neustále sa prispôsobovať. To je dôvod, prečo sme investovali do technológie, ktorá kombinuje fázovú detekciu so spätnou väzbou v reálnom čase, a máme systém špeciálne navrhnutý pre dlhé prevádzky: Live Cell Imaging System. Ak robíte časozber deliacich sa buniek, neurónové siete alebo čokoľvek, čo mení tvar v priebehu hodín, AF tohto systému je kalibrovaná tak, aby sledovala ohniskovú rovinu každých pár sekúnd, nielen na začiatku. Automaticky sa prispôsobuje teplotnému posunu monitorovaním teploty objektívu v reálnom čase – takže ak sa šošovka čo i len trochu zahreje, upraví zaostrenie skôr, ako si to všimnete.
Počkajte, povedzme si to jasne: čísla presnosti sa líšia podľa prípadu použitia a nehádame len náhodnú mikrónovú špecifikáciu. Napríklad pri zobrazovaní fixných buniek objektívmi 40x alebo 60x je naša presnosť AF konzistentne pod 1 mikrón, dokonca aj na 96-jamkovej platni. Pre prácu s vysokým 100-násobným zväčšením je to okolo 0,7 mikrónu, čo je dostatočne pevné na zachytenie detailov, ako sú mikroklky alebo jednotlivé synapsie. Pri časozberných behoch živých buniek počas 24 hodín meriame drift menší ako 2 mikróny – niečo, čomu sa väčšina rozpočtových systémov nemôže priblížiť. Ale tu je nakopnutie: presnosť je zbytočná, ak je pomalá. Ak vášmu AF trvá 2 sekundy, kým sa zablokuje, strácate čas medzi jamkami, v horšom prípade vám chýbajú dynamické udalosti, ako je delenie buniek. Naše systémy to dokážu za menej ako 500 milisekúnd, čo je dostatočne rýchle pre viacjamkové platne a dokonca aj pre rýchlo sa pohybujúce bunky, ako sú migrujúce imunitné bunky.
Ďalšou oblasťou, o ktorej väčšina ľudí nehovorí, je inteligentné skenovanie a ako to súvisí s presnosťou automatického zaostrovania. Ak zobrazujete 3D vzorku, napríklad sféroid alebo organoid, nemôžete sa sústrediť len na jednu rovinu – musíte si vziať z-zásobníky a každý z-výrez musí byť presne zaostrený. To je miesto, kde prichádza na rad náš systém inteligentného skenovania Live Cell. Používa mapovací algoritmus na predbežné skenovanie vzorky, identifikáciu najlepších ohniskových rovín a automatické nastavenie AF pre každý z-výrez. Už žiadne hádanie, kde sú bunky v zásobníku, žiadne rozmazané stredné rezy. Nedávno sme to testovali so zákazníkom, ktorý študoval inváziu rakovinových sféroidov; ich starý systém by vynechal 30 % bunkových vrstiev v sféroide, ale s naším systémom bola chybovosť nižšia ako 5 %. To je druh presnosti, ktorý v skutočnosti posúva výskum vpred, nielen spĺňa špecifikácie.
Zaoberme sa aj bežnou mylnou predstavou: vyššie rozlíšenie znamená lepšiu presnosť AF, ale sú prepojené, nie rovnaké. Rozlíšenie je o tom, koľko detailov môžete vidieť, zatiaľ čo presnosť AF je o tom, ako presne ste v správnej ohniskovej rovine. Môžete mať fotoaparát so super vysokým rozlíšením, ale ak je váš AF vypnutý o 2 mikróny, toto rozlíšenie nezískate, nech sa deje čokoľvek. Vidíme to neustále u zákazníkov, ktorí upgradujú svoje fotoaparáty, ale zostanú pri AF starého systému – skončia sklamaní, pretože obrázky sú stále rozmazané, dokonca aj s lepším fotoaparátom. Preto vždy hovoríme ľuďom, aby pri výbere systému na zobrazovanie buniek považovali AF za základnú zložku, nie za dodatočný nápad.
A čo ľudský faktor? Dokonca aj ten najpresnejší AF systém bude mať problémy, ak vaša vzorka nie je pripravená správne, ale to je samozrejmosť. Znečistené krycie sklíčko, nerovnomerná hustota výsevu alebo bubliny v médiu môžu vyhodiť akýkoľvek systém AF. Dobrý systém však bude mať zabudované kontroly, ktoré ich odfiltrujú – ako napríklad náš algoritmus AF, ktorý preskakuje oblasti s vysokým šumom na pozadí alebo nečistotami, takže sa nezablokuje na nesprávnom mieste. Tento algoritmus sme kalibrovali počas tisícok cyklov, takže sme sa naučili rozpoznať rozdiel medzi skutočnou bunkou a zrnkom prachu, čo vám ušetrí presnímanie celých platní.
Mal by som spomenúť aj údaje z reálneho sveta, pretože čísla na papieri nič neznamenajú, pokiaľ nedržia v laboratóriu. Minulý rok sme spolupracovali s tímom v univerzitnom laboratóriu kmeňových buniek, ktorý zobrazoval indukované pluripotentné kmeňové bunky (iPSC) diferencujúce sa na kardiomyocyty. Ich starý systém mal chybu AF 3-4 mikróny, čo znemožňovalo sledovať bijúce bunky počas 72 hodín – museli by sa každú hodinu znova zaostrovať, čo narušilo živé bunky. Po prechode na náš systém Live Cell Imaging System bola ich presnosť AF pod 1,5 mikrónu počas 72 hodín a boli schopní získať nepretržité údaje o rýchlostiach úderov buniek bez akéhokoľvek manuálneho zásahu. To je druh vplyvu, ktorý má dobrá presnosť AF na skutočný výskum, nielen na technické špecifikácie.
Iný príklad: skríning s vysokým obsahom, pri ktorom zobrazujete stovky jamiek v jednom cykle. Ak je vaša AF nekonzistentná medzi jamkami, môžete získať dobré údaje z prvej platne a zlé údaje z 10., pretože ohnisko sa medzi jamkami posunulo. Naše systémy majú kalibračnú funkciu, ktorá vykonáva rýchlu kontrolu zaostrenia v každej jamke pred zobrazením, pričom sa upraví na akékoľvek malé rozdiely v spodnej časti jamky alebo v polohe vzorky, takže presnosť je konzistentná v celej platni. To je veľká vec pre skríning liekov, kde potrebujete spoľahlivé, reprodukovateľné údaje z každej jamky – ak je jedna jamka vypnutá, môže to skresliť výsledky celej obrazovky.
Teraz si povedzme o tom, ako si skutočne otestovať presnosť AF na vlastnej koži, pretože to by ste mali urobiť pred kúpou akéhokoľvek systému, nielen brať naše slovo. Tu je rýchly tip: použite terč so štandardným rozlíšením (napríklad terč USAF 1951), ktorý je namontovaný na krycom sklíčku, a zobrazte ho v rôznych pozíciách. Rozdiel medzi skutočnou ostrou pozíciou a pozíciou, o ktorej systém hovorí, že je ostrá, je vaša chyba AF. Ale robte to v podmienkach, ktoré zodpovedajú vašim skutočným behom – ak pracujete so živými bunkami s fluorescenčnými proteínmi, použite cieľ s fluorescenčným rozlíšením, nie len svetlé pole, pretože práve to bude váš systém používať na AF. Testujte tiež v priebehu času – spustite časozber na 24 hodín a skontrolujte posun, pretože vtedy presnosť najčastejšie zlyháva.
Ak vás už nebavia rozmazané obrázky, strácate čas opakovaním experimentov alebo nekonzistentné údaje, dobrou správou je, že sa nemusíte uspokojiť s podpriemernou presnosťou AF. Naše systémy sú postavené s ohľadom na skutočné potreby laboratória, nielen na marketingové špecifikácie. Či už robíte zobrazovanie s fixnými bunkami, dlhodobý časozber živých buniek, skríning s vysokým obsahom alebo 3D vzorové zobrazovanie, máme technológiu prispôsobenú tak, aby vaše zameranie zostalo uzamknuté tam, kde je potrebné. Systém Live Cell Imaging System je ideálny pre dynamické, dlhé jazdy, zatiaľ čo systém inteligentného skenovania Live Cell ušetrí prácu pri skenovaní zložitých vzoriek pomocou presného automatického automatického zaostrovania.
Ak ste pripravení prestať sa zaoberať rozmazanými obrázkami a začať získavať spoľahlivé, reprodukovateľné údaje, radi si pokecáme. Obráťte sa na nás a porozprávajte sa o svojich konkrétnych experimentoch, otestujte naše systémy vo svojom vlastnom laboratóriu a zistite, ako môže presnosť AF zmeniť váš výskum. Nerobíme univerzálne riešenia, takže s vami budeme spolupracovať pri hľadaní systému, ktorý vyhovuje vašim potrebám, nie naopak.
Referencie
- Waters, JC (2009). Presnosť a presnosť v kvantitatívnej fluorescenčnej mikroskopii. Journal of Cell Biology, 185(7), 1135-1148.
- Smith, AP, a kol. (2018). Techniky automatického zaostrovania pre zobrazovanie živých buniek: Praktická príručka pre biológov. BMC Cell Biology, 19(1), 1-12.
- Chen, L., a kol. (2021). Zníženie posunu zaostrenia pri dlhodobom zobrazovaní živých buniek: Technické prístupy a aplikácie. Laboratórium na čipe, 21(12), 2245-2260.
- Medzinárodná spoločnosť pre pokrok v cytometrii. (2020). Osvedčené postupy pre automatické zaostrovanie pri zobrazovaní buniek s vysokým obsahom. Cytometria časť A, 97(11), 1089-1101.
