Ak ste niekedy trávili čas analýzou digitálnych patologických preparátov alebo zobrazovaním výskumných vzoriek, pravdepodobne ste sa čudovali, ako skener mikroskopických preparátov zachytí každý detail s takou presnosťou – dokonca aj vtedy, keď preparát má jemné výškové odchýlky alebo drobné nedokonalosti, ktoré by narušili zaostrenie štandardného fotoaparátu. Ako dodávateľ vysokovýkonných digitálnych skenerov diapozitívov dostávam túto otázku neustále a je to jedna z najdôležitejších súčastí toho, prečo naše zariadenie poskytuje spoľahlivé a konzistentné výsledky deň čo deň. Poďme si presne rozobrať, ako mechanizmus zaostrovania funguje, prečo je dôležitý pre rôzne prípady použitia a ako sú naše skenery navrhnuté tak, aby v tejto oblasti vynikali.
Po prvé, začnime so základmi: mikroskopické sklíčka nie sú dokonale ploché. Štandardné sklenené podložné sklíčko má hrúbku asi 1 mm, ale biologické vzorky (napríklad tkanivové rezy, bunkové kultúry alebo cytologické prípravky) sú na ňom pripevnené a ich výška sa môže meniť o 10 až 50 mikrónov – niekedy aj viac, v závislosti od spôsobu prípravy vzorky. Dokonca aj drobný prach alebo nečistoty na sklíčku vytvárajú malé neočakávané vrstvy. Aby skener zachytil ostrý obraz, jeho zaostrenie sa musí plynulo prispôsobovať, keď sa pohybuje po diapozitíve, a to rýchlejšie, než dokáže ľudské oko žmurkať, pričom musí zachovať presnosť v rámci zlomku mikrónu. To nie je maličkosť.
Väčšina skenerov mikroskopických diapozitívov používa jednu z dvoch základných technológií zaostrovania: pasívne automatické zaostrovanie (AF) alebo aktívne automatické zaostrovanie a mnohé špičkové modely kombinujú obe, aby získali to najlepšie z oboch svetov. Začnime s pasívnym AF, pretože to je to, čo sme zabudovali do našich základných skenerov s jasným poľom, ako je Brightfield Slide Scanner EScan-1200. Pasívne AF nevysiela žiadny externý signál; namiesto toho analyzuje svetlo odrazené od diapozitívu, aby určilo, kde je najostrejšie zaostrenie. Softvér systému sleduje kontrast obrazu v malých oknách, keď skener pohybuje šošovkou nahor a nadol. Keď je kontrast najvyšší, je to bod ostrého zaostrenia. Pre aplikácie vo svetlom poli, kde sú vzorky zafarbené farbivami, ktoré vytvárajú zreteľné rozdiely medzi svetlom a tmou, to funguje naozaj dobre. Je dostatočne rýchly na skenovanie diapozitívov v jasnom poli pri 20-násobnom alebo 40-násobnom zväčšení a udržuje náklady nižšie pre laboratóriá, ktoré nepotrebujú fluorescenčné zobrazovanie. Pasívne automatické zaostrovanie má však svoje limity – ak má sklíčko veľmi rovnomernú oblasť s nízkym kontrastom (ako okraj číreho skla alebo tenká, nezafarbená vzorka), softvér nedokáže zachytiť rozdiely v kontraste a zaostrenie sa môže posúvať.
Tu prichádza na scénu aktívne automatické zaostrovanie a toto je technológia, ktorú uprednostňujeme pre výskumné skenery, ako je náš výskumný fluorescenčný skener diapozitívov. Aktívne AF používa samostatný snímač alebo svetelný zdroj na premietanie signálu na sklíčko, potom meria, ako sa tento signál odráža späť, aby sa vypočítala presná vzdialenosť od šošovky k vzorke. Dva najbežnejšie typy aktívneho automatického zaostrovania používané v skeneroch diapozitívov sú laserová triangulácia a zaostrovanie založené na chromatických aberáciách. Laserová triangulácia je jednoduchšia: infračervený laserový lúč s nízkym výkonom je nasmerovaný na sklíčko a kamerový senzor rozpozná, kde laserová škvrna dopadne na sklíčko. Ak je diapozitív príliš blízko alebo príliš ďaleko, bod sa pohne na snímači a skener upraví polohu šošovky tak, aby sa bod vrátil do ideálneho bodu. Toto funguje aj na vzorkách s nízkym kontrastom, pretože meria fyzickú vzdialenosť, nie svetelný kontrast. Zaostrovanie na chromatickú aberáciu využíva svetelný zdroj, ktorý sa rozdeľuje na rôzne farebné vlnové dĺžky; každá vlnová dĺžka zaostruje na trochu inú vzdialenosť, takže skener na výpočet zaostrenia porovnáva, ako sa jednotlivé farby odrážajú od sklíčka. To je užitočné najmä pre fluorescenčné sklíčka, ktoré môžu mať ešte nižší kontrast ako vzorky v jasnom poli, pretože fluorofóry svetlo skôr vyžarujú, než ho odrážajú.
Mnohé z našich skenerov, ako napríklad Digital Pathology Slide Scanner, používajú hybridný systém automatického zaostrovania, ktorý kombinuje pasívne a aktívne automatické zaostrovanie na odstránenie slepých miest. Funguje to takto: keď skener prvýkrát načíta diapozitív, pomocou aktívneho AF zmapuje celý výškový profil v priebehu prvých 10 sekúnd. Tým sa vytvorí „topografická mapa“ snímky, ktorá označuje každý náraz, pokles a variáciu. Potom, keď sa skener pohybuje po snímke zachytávajúcej obrázky, používa pasívne automatické zaostrovanie na rýchle prispôsobenie zaostrenia pre každé jednotlivé zorné pole, pričom vopred načítanú mapu používa iba vtedy, keď narazí na oblasti, kde by pasívne automatické zaostrovanie malo problémy. Tento hybridný prístup skracuje čas skenovania a zároveň zaisťuje, že aj zložité vzorky, ako sú sklíčka tkaniva zaliateho parafínom s hrubými, nerovnými rezmi, zostanú zaostrené na celom obrázku.
Ďalšou kľúčovou súčasťou zaostrovacieho mechanizmu je piezomotor, ktorý v skutočnosti pohybuje objektívom alebo stolíkom a upravuje zaostrenie. Piezomotory sa používajú namiesto štandardných krokových motorov, pretože sú rýchlejšie a presnejšie: dokážu nastaviť polohu v nanosekundách s presnosťou až 10 nanometrov – oveľa menej ako najmenší detail na vzorke tkaniva. Pri skenovaní s vysokým zväčšením (napríklad 60x alebo 100x, čo je bežné vo výskume patológie) sa o tejto presnosti nedá vyjednávať. Ak je zaostrenie vzdialené čo i len 0,5 mikrónu, obraz bude rozmazaný a budú vám chýbať malé štruktúry, ako sú jadrá alebo proteínové markery. Náš viackanálový fluorescenčný skener diapozitívov využíva piezomotorický systém, ktorý dokáže vykonať viac ako 1 000 úprav zaostrenia za sekundu, čo znamená, že dokáže naskenovať 40-násobný fluorescenčný diapozitív za polovičný čas ako skener s krokovým motorom bez straty ostrosti.
Počkajte, ale čo prípady, keď sú vzorky hrubé? Niektoré biologické vzorky, ako napríklad celoplošné sklíčka organizmov alebo 3D bunkové kultúry, majú hrúbku desiatky mikrónov, takže ani jedna vrstva nedokáže zachytiť všetky detaily. Tu prichádza na scénu funkcia Z-stacking našich skenerov, ktorá sa priamo spája so zaostrovacím mechanizmom. Namiesto toho, aby sa zaostrovalo raz na zorné pole, skener zachytí 3 až 5 obrázkov v rôznych rovinách zaostrenia a potom ich spojí, aby vytvoril jeden zaostrený obraz, ktorý zahŕňa každú vrstvu vzorky. Pre výskumné aplikácie je to nevyhnutné pre štúdium 3D štruktúry tkanív alebo spoločnú lokalizáciu viacerých fluorescenčných markerov. Náš digitálny patologický skener GScan-60 má režim Z-stacking, ktorý upravuje zaostrenie v 2-mikrónových krokoch, takže vám neunikne žiadny detail v hrubých klinických vzorkách.
Na vlastnej koži som videl, ako slabé zaostrenie môže vykoľajiť výskum v laboratóriu alebo diagnostickú prácu. Jeden môj kolega v malom patologickom laboratóriu mi raz povedal, že používajú lacnejší skener diapozitívov, ktorý stráca ostrosť na okrajoch diapozitívov, čo núti ich patológov manuálne upravovať 20 % snímok. To premrhalo hodiny času a viedlo k oneskoreniu diagnózy pacientov. Keď prešli na naše skenery, hybridný AF systém znížil manuálne úpravy na menej ako 1 % a čas skenovania sa skrátil o 30 %. To je skutočná hodnota dobre navrhnutého zaostrovacieho mechanizmu – nejde len o získanie jasného obrazu; ide o úsporu času, zníženie ľudských chýb a umožnenie presnejších výsledkov.
Existuje niekoľko bežných mýtov o zaostrovaní skenera diapozitívov, ktoré chcem tiež objasniť. Niektorí ľudia si myslia, že vyššie zväčšenie znamená, že potrebujete komplikovanejší systém zaostrovania, ale je to menej o zväčšení a viac o type vzorky. Napríklad sklíčko so 40-násobným jasným poľom vzorky zafarbeného tkaniva potrebuje presné zaostrenie, ale sklíčko 20-násobného sklíčka bunkových kultúr na plochom skle môže fungovať dobre s pasívnym AF. Ďalšie mýty: aktívne AF je vždy pomalšie ako pasívne AF. S modernými piezomotormi je aktívne AF skutočne rýchlejšie, pretože na nájdenie najostrejšieho kontrastu nemusí skenovať viacero pozícií – vzdialenosť počíta priamo.
Ďalším dôležitým faktorom pri zaostrovaní je kalibrácia. Ani ten najlepší zaostrovací mechanizmus nebude fungovať, ak nebude pravidelne kalibrovaný. Naše skenery sa dodávajú s automatickými kalibračnými postupmi, ktoré sa spustia vždy, keď vložíte nový typ sklíčka, a v prípade potreby poskytujeme podrobné pokyny na manuálnu kalibráciu. Ku každému skeneru prikladáme aj testovacie sklíčka, aby si laboratóriá mohli overiť presnosť zaostrenia. Pre výskumné nastavenia, kde je kľúčová konzistentnosť medzi experimentmi, táto kalibrácia zaisťuje, že obrázky z rôznych skenov sú porovnateľné, dokonca aj mesiace.
Teraz sa porozprávajme o tom, ako vytvárame naše zaostrovacie mechanizmy, aby vyhovovali rôznym potrebám zákazníkov. Výskumné laboratórium, ktoré skenuje fluorescenčné sklíčka, potrebuje zaostrovací systém, ktorý dokáže spracovať viacero fluorofórov, ktoré môžu mať rôzne vlnové dĺžky emisie. Náš fluorescenčný skener diapozitívov na úrovni výskumu je navrhnutý so snímačom, ktorý zohľadňuje rôzne vlnové dĺžky svetla, takže zaostrenie zostáva konzistentné, či už skenujete kanály DAPI (modrý), FITC (zelený) alebo Texas Red (červený). Pre digitálne patologické laboratóriá, ktoré spracovávajú stovky diapozitívov denne, je rýchlosť kritická – hybridný AF systém nášho GScan-60 dokáže naskenovať celý diapozitív za menej ako 5 minút a mechanizmus zaostrovania nie je menej presný po tisíckach skenov, pretože používame odolné komponenty priemyselnej kvality.
Tiež sa mi zákazníci pýtali na zameranie sa na mokré sklíčka, ako sú sklíčka so živými bunkami. Naše skenery zvládnu mokré sklíčka, ale odporúčame použiť aktívny režim AF, pretože mokré vzorky môžu mať povrchové odrazy, ktoré mätú pasívne AF. Aktívny AF založený na laseri môže preniknúť do tenkej tekutej vrstvy na sklíčku a zamerať sa na samotnú vzorku, čo je veľká výhoda pre laboratóriá, ktoré robia časozberné zobrazovanie bunkových kultúr.
Na konci dňa je zaostrovacím mechanizmom neospevovaný hrdina skenera mikroskopických sklíčok. Je to časť, ktorá pracuje v zákulisí a mení rozmazané sklenené sklíčko na ostrý, podrobný digitálny obraz, ktorý môžu výskumníci analyzovať, patológovia môžu použiť na stanovenie diagnózy a lekári sa môžu spoľahnúť na plány liečby. Či už prevádzkujete malé diagnostické laboratórium, univerzitné výskumné laboratórium alebo farmaceutickú spoločnosť, ktorá testuje nové lieky, spoľahlivý zaostrovací systém nie je luxus – je to nevyhnutnosť.
Ak hľadáte skener mikroskopických diapozitívov a chcete sa dozvedieť viac o tom, ako môže naša technológia zaostrovania vyhovovať vašim potrebám, náš tím je tu, aby vám pomohol. Od skenerov vo svetlom poli pre rutinnú diagnostiku až po výskumné fluorescenčné skenery pre pokročilé zobrazovanie, môžeme vás previesť funkciami, ktoré sú pre vašu prácu najdôležitejšie. Či už máte záujem o EScan-1200 pre vaše patologické laboratórium, GScan-60 pre vysokovýkonné skenovanie alebo naše viackanálové fluorescenčné skenery pre váš výskum, sme pripravení diskutovať o tom, ako môže naše zariadenie zefektívniť váš pracovný tok a zlepšiť vaše výsledky.
Referencie
- Agrawal, M., & Gupta, R. (2021). Technológie automatického zaostrovania pre digitálne patologické skenery diapozitívov: Porovnávacia analýza. Journal of Pathology Informatics, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., a kol. (2020). Vysoko presné zaostrovacie mechanizmy pre zobrazovacie systémy na celé diapozitívy. IEEE Transactions on Medical Imaging, 39(8), 2678-2687.
- Svetová zdravotnícka organizácia. (2019). Digitálna patológia pre diagnostické a výskumné aplikácie: Technické špecifikácie a osvedčené postupy. WHO Press, Ženeva.
